熒光標記的siRNA  Fluorescent dye labeled siRNA

熒光標記的siRNA

我們可對siRNA末端用多種熒光標記物進行標記。標記后的siRNA可用流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到，確定轉染效率，優(yōu)化轉染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。

我們可對siRNA末端用多種熒光標記物進行標記。標記后的siRNA可用流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到，確定轉染效率，優(yōu)化轉染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。反義鏈5'端標記會影響其基因沉默活性，所以不推薦在這一位點進行標記。在其他三個末端修飾對沉默活性幾乎沒有影響。我們推薦在正義鏈的5'端修飾，目前公認這是*佳的化學標記位點。

本公司提供的siRNA相關產(chǎn)品直接作用于靶基因mRNA，因此我們建議您在收到我們的相關產(chǎn)品后先進行實時定量PCR檢測，以確定靶基因mRNA表達水平的變化，進而直接確認我們合成或構建的siRNA產(chǎn)品是否有效。

使用方法

一、熒光標記的siRNA

轉染效率的高低可以通過熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）實現(xiàn)。

FAM-siRNA 轉染細胞后，可以用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測，確定是否有效轉染和優(yōu)化轉染條件。FAM-siRNA 還可用作siRNA 胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA 的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。

二、使用熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）檢測轉染效率

1 FAM-siRNA的溶解及保存

1.1 由于OligoRNA很輕的干膜狀附在管壁上，打開時極易散失，所以打開離心管前先離心，然后再慢慢打開管蓋，溶解時加適量DEPC水后蓋上管蓋，振蕩溶解。

1.2 需要濃度20uM的樣品，如何計算重懸siRNA緩沖液的量？你購買了1OD的siRNA，想溶解為20uM 的樣品，應該使用150ul附送的DEPC水去重懸1OD的siRNA,溶解后為20uM的樣品。

1.3 貯存和穩(wěn)定性：-20℃，避光保存，凍干粉或液體。液體（貯存濃度為20μM）避免反復凍融，**********保證在上述條件下siRNA oligo的穩(wěn)定性可達到6個月。

2 轉染

2.1 使用lipofectamin2000 轉染的步驟（以貼壁細胞為例，僅供參考）

(1)以24孔培養(yǎng)板操作為例（其他孔板各種的試劑用量，請參照“Lipofectamine2000 manual”），轉染前**，將0.5~2X105個細胞接種于培養(yǎng)板中，每孔中加入約500ul無抗生素的培養(yǎng)基，使轉染時的細胞密度能夠達到30～50％；

(2) 取1μl/孔 Lipofectamine2000（使用前輕輕搖勻），用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和后在室溫孵育5 min；

(3) 取2ul FAM-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀釋，輕輕混和均勻;

(4) 稀釋的Lipofectamine2000（2）經(jīng)過5min 的孵育后，與稀釋FAM-siRNA（3）輕輕混和，室溫靜置20min，以形成FAM-siRNA-轉染試劑混和物，如果溶液出現(xiàn)渾濁，屬于正?，F(xiàn)象，不會影響轉染效果。

注意：稀釋的Lipofectamine2000（2）盡量在25min 之內，和稀釋的FAM-siRNA 混和，如果放置時間過長，可能導致轉染試劑活性的降低;

(5) 將FAM-siRNA-轉染試劑混和液（4）加入含有細胞及培養(yǎng)液（約含400ul）的孔中，輕輕搖晃孔板，使混和；

(6) 在37 ℃的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-6 小時后可將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基(該步驟可以省略);

(7)轉染6小時后即可檢測轉染效率：流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等（見后面）。

2.2 轉染操作注意事項：

（1）FAM-siRNA 的轉染過程和普通siRNA 是一樣的，注意整個實驗過程要盡量避光，建議轉染時室內和超凈臺內不要開燈；

（2）保持FAM-siRNA 管外有錫紙包裹，在靜置lipo-siRNA 過程中盡量避光，

（3）轉染操作盡量快，操作時間盡量短，操作完畢請盡快將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱。

（4）一般來說，使用Lipofectamine 2000 作為轉染試劑，4～6 小時就可以保證siRNA 轉染進入細胞。因此轉染效率的檢測可以在轉染后6小時（轉染過程完成）進行。

3、觀察與檢測

3.1 檢測方法：熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀

3.2 熒光顯微鏡觀察注意事項（流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測請參照儀器說明書）：

（1）FAM 是一種綠色熒光基團，由藍光激發(fā)，激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長520nm。

（2）使用Lipofectamine 2000 轉染后6 小時就可以檢測，檢測前細胞處理等操作都必須避光！對于檢測的時間要求相對不是特別嚴格，成功轉染的細胞如果沒有受到強光刺激的話，熒光一般不會消失，我們建議盡量在轉染后24 小時內完成檢測。

（3）確保熟悉熒光顯微鏡操作。建議檢測時，可以先使光路先對準沒有轉染FAM -siRNA的孔，調好焦距打開激發(fā)光，一切準備就緒后再進行觀察（一般情況下可以馬上看到熒光）。

（4）觀察時間不宜過長，盡量避免熒光被猝滅，光路對準轉染孔，馬上觀察和拍照。拍完熒光照片后，*好在同一視野中拍下明場的細胞照片。

（5）只有成功轉染的細胞才能看到FAM 綠色熒光，與綠色熒光蛋白GFP 的熒光不太一樣，F(xiàn)AM 的熒光比較弱，散在分布在細胞質中。

（6）由于熒光容易猝滅，應用計數(shù)的方法計算轉染效率效果不好，*好用流式細胞儀檢測。

（7）如果您對我們FAM-siRNA 質量有任何質疑的話，您可以從中吸取少量（2～5μl）FAM-siRNA，加在載玻片上，蓋上蓋玻片，直接于熒光顯微鏡下觀察。注意保證FAM-siRNA 的保存和使用方法無誤，另外，所有操作都必須在避光條件下進行。

選擇合肥星肽生物科技有限公司的理由

生產(chǎn)實力雄厚

合肥星肽生物科技有限公司擁有近2000平方米獨立研發(fā)中心以及無菌實驗室4條完善的多肽生產(chǎn)線，單月可交貨3000條多肽精品，生產(chǎn)研發(fā)速度快，可快速相應您的需求。

技術設備先進

合肥星肽生物科技有限公司實驗室配備了waters LC-MA/MS、waters uplc，waters全自動純化儀、島津LCMS、全自動凍干系統(tǒng)、紫外分光光度計等專用精密儀器，為您提供高效專業(yè)的技術服務。

客戶服務完善

合肥星肽生物科技有限公司廣大客戶提供專業(yè)的前沿產(chǎn)品、合理的價格、便捷的物流服務，幫助客戶縮短科研周期、節(jié)省試驗成本，使客戶的科學研究具有持續(xù)性。

關于合肥星肽生物科技有限公司

合肥星肽生物科技有限公司是一家致力于生命科學和生物技術領域的高科技企業(yè)，公司地址位于科教名城———合肥市。公司主營多肽合成、多肽定制、多肽純化等多肽制備多肽技術服務。在合肥市與中科院的關懷下，2021年初合肥市高新區(qū)與中科院分別與合肥星肽生物科技有限公司簽訂了戰(zhàn)略投資協(xié)議。 公司位于合肥市高新區(qū)安徽中科資城創(chuàng)業(yè)孵化器A區(qū)，擁有2000平方米獨立研發(fā)中心以及無菌實驗室，四條完善的多肽生產(chǎn)線，配備了Waters LC- MS/MS、Waters UPLC、Waters 全自動純化儀、島津LCMS、全自動凍干系統(tǒng)、紫外分光光度計等專用精密儀器保障合肥星肽生物科技有限公司月產(chǎn)3000條精品多肽的生產(chǎn)能力，這些得以讓我們可以為客戶快速準確的提供各種高質量的多肽產(chǎn)品及服務。 合肥合肥星肽生物科技有限公司始終致力于為您的實驗研究提供高品質、穩(wěn)定性良好的產(chǎn)品，“做您身邊的多肽合成專家”一直是每個合肥星肽生物科技有限公司人的目標與方向，勵志作為多肽合成行業(yè)標準的風向標。公司擁有100余人的專業(yè)團隊，其中博士研究生、碩士研究生10余人。在此基礎上公司配備了一套包含從售前到售后的專業(yè)團隊，力爭做到每個環(huán)節(jié)都“清晰明了”，對每一個問題都“吹毛求疵”，讓您的實驗變得更加簡單，正是憑借這樣的信仰和扎實的多肽合成技術優(yōu)勢，合肥星肽生物科技有限公司已經(jīng)成為國內外高校與眾多生物醫(yī)藥企業(yè)誠信的合作伙伴和堅強的技術后盾。 公司秉承“專業(yè)鍛造品質，服務打造市場”的經(jīng)營理念，為國內廣大客戶提供專業(yè)的前沿產(chǎn)品、合理的價格、便捷的物流服務。 公司自成立以來，一直致力于多肽合成、多肽定制、多肽純化等多肽制備多肽技術服務的研究。幫助客戶縮短科研周期、節(jié)省試驗成本，使客戶的科學研究具有持續(xù)性。 實驗室配備一支年輕、專業(yè)、富有創(chuàng)造精神且經(jīng)驗豐富的技術團隊。 合肥星肽生物科技有限公司目前跟國內外企業(yè)有著友好的合作往來。斯坦福大學，牛津大學，北京大學，清華大學，天津大學，浙江大學，中科大，香港理工大學，以及中科院遺傳所，過程所，化學所，生物細胞所，微生物所等，北京軍科院**醫(yī)學研究所，武漢病毒研究所等有穩(wěn)定合作。

訂購信息

產(chǎn)品留言

標題

聯(lián)系人

聯(lián)系電話

內容

驗證碼

點擊換一張

注：1.可以使用快捷鍵Alt+S或Ctrl+Enter發(fā)送信息!
2.如有必要,請您留下您的詳細聯(lián)系方式!